Kristallisation von Proteinen
Die Voraussetzung zur Herstellung von Proteinkristallen sind ausreichende Mengen an hochreinem Protein, das über verschiedene Verfahren hergestellt und gereinigt werden kann.
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Informationen
In der AG Scheerer können für die Proteinreinigung zwei Chromatographiesysteme (GE HealthCare Lifescience ÄKTAprime plus und ÄKTApurifier 10) im Verbund mit einer statischen Lichtstreuung (WYATT –DAWN HELEOSII - 18-angle MALS light scattering detector) und einem Refraktometer (WYATT Optilab T-rEX - Differential Refractometer with Extended Range) eingesetzt werden.
Hintergrund
Für die meisten Proteine sind sehr begrenzte Bereiche z.B. des pH-Wertes, der Temperatur oder des Lösungsmittels notwendig, um die Stabilität zu gewährleisten. Geeignete Kristallisationsbedingungen findet man anschließend, indem man hochkonzentrierte Proteinlösungen (ca. 1–40 mg Protein/ml) mit verschiedenen Puffer-Lösungen, die zumeist sehr hohe Konzentrationen an Salzen, Alkoholen oder Polyethylenglykolen enthalten, in kleinen Tropfen mit Volumina im Nano- bis Mikroliterbereich vermischt, luftdicht abschließt und über einen Zeitraum (Tage bis Monate) bei konstanter Temperatur stehen lässt.
Methoden
Die AG Scheerer verwendet die üblichen Methoden zur Kristallisation wie Dampfdiffusion ("sitting & hanging drop"), Kristallisation unter Öl ("Microbatch"), Mikrodialyse oder Mikro- und Makroseeding von Kristallen verwendet. Mit Hilfe von standardisierten Bedingungen ("sparse-matrix-Technik") können wir aus ca. 4000 Bedingungen systematisch herausfiltern, wo eine Kristallisation des Proteins möglich ist. Hierfür werden zwei Kristallisations-Roboter (der TTP LabTech's mosquito , der bei einer Temperatur von 4°C in einem eigenen Kühlraum in Betrieb ist, und der Art Robbins Instruments Gryphon LCP, der bei 20°C auch "lipid cubic phase" Ansätze ermöglicht) verwendet. Weiterhin stehen diverse temperaturstabile Kristallisationsschränke, die bei verschiedenen Temperaturen ( 4°C, 6°C, 10°C, 18°C, 22°C, 25°C, 34°C) betrieben werden, ein Kristallisationskühlraum, ein automatisches Imaging System (Formulatrix Rock Imager 182), ein UV-Mikroskop (Formulatrix MUVIS) zur Identifizierung von Proteinkristallen, diverse Stereomikroskope und verschiedene Lichtbedingungen für photosensible Proteine zur Verfügung.
Die Kristallisation von Membranproteinen ist häufig außerordentlich schwierig. Es wird aus diesem Grund am Institut für Medizinische Physik und Biophysik auch auf die Techniken der in surfo- ("detergent micelles methods"), bilayer- ("bicelle methods") und der in meso-Kristallisation ("lipid cubic phase methods") zurückgegriffen. Für letztere Methode stehen jetzt sowohl manuelle und automatische Lipid-Mixer also auch der Art Robbins Instruments Gryphon LCP Kristallisationsroboter zur Verfügung.