Wissenschaftliche Grundlagen der Cullin4-RING-Ubiquitinligasen

Erfahren Sie auf dieser Seite Hintergrundwissen zum Stand der Forschung auf dem Gebiet der Ubiquitylierung, mit dem Schwerpunkt auf Cullin4-RING-E3-Ubiquitinligasen.

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Hintergrund

Ubiquitylierung und das Ubiquitin-Proteasom System

Ubiquitin ist ein in Eukaryonten hochkonserviertes, stabiles Protein mit einem Molekulargewicht von 8.5 kDa. Die enyzmatisch katalysierte kovalente Bindung von Ubiquitin an Lysin-Aminosäureseitenketten zellulärer Substratproteine, genannt Ubiquitylierung, reguliert deren intrazelluläre Proteolyse, Proteininteraktionen, Enyzmaktivitäten und subzelluläre Lokalisation [6]. Der Ubiquitylierungsprozess wird durch Thiolesterbindung des Ubiquitin-C-terminus an eine Cysteinseitenkette des aktivierenden Enzyms (E1) eingeleitet. Das aktivierte Ubiquitin wird daraufhin auf eine Cysteinseitenkette eines Trägerproteins (E2) übertragen. Die abschließende Ausbildung einer Amid-Isopeptidbindung zwischen dem Ubiquitin-C-terminus und der Aminogruppe einer Lysinseitenkette des zellulären Substratproteins wird von E3-Ubiquitinligasen katalysiert [7]. Substratgebundenes Ubiquitin selbst kann anschließend am N-terminus oder jeder seiner sieben Lysinseitenketten ubiquityliert werden, was in einem repetitiven Prozess zur Polyubiquitylierung führt. Die Anzahl und die Art der Ubiquitinverknüpfungen stellen einen Code dar, der von Ubiquitin-Bindedomänen zellulärer Effektorproteine ausgelesen wird; dies führt wiederum zu den entsprechenden zellulären Reaktionen [6]. 

Ein bedeutender Aspekt der Polyubiquitylierung ist die Regulation intrazellulärer Proteinkonzentration durch das Ubiquitin-Proteasom-System [8]. Das Proteasom ist eine vom Cytoplasma abgetrennte Protease, bestehend aus einem zylindrischen Kernkompartiment, das auf beiden Seiten von regulatorischen Partikeln abgedeckt ist [9, 10]. Hauptsächlich Lysin-48-verknüpfte, aber auch andere Arten von Polyubiquitylierung werden von der regulatorischen Untereinheit erkannt und gebunden [11, 12]. Dadurch wird das Substratprotein einem benachbarten Entfaltungsenzym zugeführt, welches die Substratproteinkette in das Kernkompartiment einfädelt. Die Innenseite der zentralen Kammer trägt Threoninprotease-Aktivitäten, die das Substrat in Peptidfragmente von durchschnittlich 7-9 Aminosäuren Länge spalten [13]. Das Ubiquitin-Proteasom als wichtigstes intrazelluläres Proteolysesystem ist unabdingbar für die Funktion des Immunsystems [14] und korrekte zeitliche und räumliche Proteinregulation in Prozessen wie z.B. der Zellzyklusregulation [15], Transkription [16] oder der Protein-Qualitätskontrolle [17.

E3 Ubiquitinligasen

Im Ubiquitylierungsprozess kommt den E3-Ubiquitinligasen besondere Bedeutung als Spezifitätsfaktor zu, da sie das ubiquitingeladene E2 mit dem Substratprotein zusammenbringen. Sie werden anhand ihres Funktionsmechanismus in drei verschieden Klassen eingeteilt: RING (Really interesting new gene) E3 Ligasen katalysieren den direkten Ubiquitintransfer vom E2 auf das Substrat, während HECT (Homology to E6AP C-terminus) und RBR (RING-between-RING) E3 Ligasen in einem zweistufigen Prozess Ubiquitin zuerst vom E2 auf einen E3-Cysteinrest und anschließend auf das Substrat übertragen [18]. RING E3-Ligasen stellen den mit Abstand zahlreichsten E3-Ligasentyp im Humangenom dar [19], und deren Funktionsweise wird im Folgenden näher beschrieben.

Einheitliches Merkmal der RING-Ligasen ist die kompakte RING Domäne mit acht konservierten Cystein- und Histidinresten, die ins Innere zeigen und die Struktur durch Koordination von zwei Zinkatomen stabilisieren. Eine Bindungstasche auf der RING-Domänenoberfläche ermöglicht transiente Interaktion mit ubiquitingeladenem E2. Räumlich getrennt von der E2-Bindungstasche besitzen RING E3-Ligasen verschiedene Substratbindedomänen, die spezifische Epitope im Substratprotein erkennen. Ein minimales Abbausignal, hinreichend für E3-Erkennung, Polyubiquitylierung und anschließende Proteolyse, wird auch als "Degron" bezeichnet [20]. Der exakte Mechanismus der RING-katalysierten Ubiquitinübertragung ist nicht endgültig geklärt, aber bisherige Studien lassen vermuten, dass einerseits Kontakte zur RING-Domäne das E2-gebundene Ubiquitin immobilisieren, und weiterhin die Degron-Substratbindedomäneninteraktion eine Lysinseitenkette des Substrats korrekt platziert, so dass der reaktive Thiolester zwischen E2 und dem Ubiquitin C-terminus attackiert werden kann [18, 21].

Cullin-RING E3-Ubiquitinligasen

Die Familie der Cullin-RING E3-Ligasen (CRL) evolvierte eine modulare Architektur, um katalytische RING-Domäne und Substrat zusammenzubringen. Zentraler Bestandteil ist ein stabiles Cullin-Gerüst, bestehend aus drei helikalen Cullin-Repeats und einer C-terminalen Domäne. Diese bindet hochaffin an ein RING-Domänen-Partnerprotein, genannt ROC/Rbx (Regulator of Cullins/RING box protein), um einen katalytischen Cullin-RING Kern auszubilden [22]. Fünf der sieben humanen Cullin-Varianten (CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5) besitzen diesen konservierten Aufbau [23]. Am der RING-Domäne gegenüberliegenden, N-terminalen Ende des Cullin-Gerüstes binden Adapterproteine, die sich je nach Cullin-Variante unterscheiden: CUL1 bindet Skp1 (S-phase kinase-associated protein), CUL2/5 binden den Elongin B/C Komplex, CUL3 assoziiert mit BTB-(Bric-a-brac, Tramtrack, Broad-complex-)Domänen und CUL4A/B mit DDB1 (DNA damage-binding protein 1).

Mit Ausnahme der CUL3-Adapter, BTB-Domänenproteine, die direkt mit dem Ubiquitylierungssubstrat interagieren, binden die übrigen Cullin-Adapter weitere variable Subtstratrezeptoren, die für die Degron-Erkennung zuständig sind. Diese Rezeptoren sind F-box Proteine für CUL1-Skp1, BC-box Proteine für CUL2/5-Elongin B/C und DCAFs (DDB1-CUL4A associated factors) für CUL4-DDB1 [24]. Aufgrund der Austauschbarkeit der Substratrezeptoren in Cullin-RING-Adapter-Rezeptor-Systemen wird die Anzahl möglicher Substratinteraktionen eines einzelnen Cullin-Gerüsts deutlich erhöht, so dass etwa 400 verschiedene Cullin-RING-Ligasekomplexe aufgebaut werden können, die für ungefähr 20% der zellulären proteasomabhängigen Proteolyse verantwortlich sind [25]. Hierbei wird außerdem deutlich, dass zum Verständnis spezifischer Cullin-RING-abhängiger Proteinregulation zwei variable molekulare Erkennungsprozesse entscheidend sind, einerseits die Anbindung des Substratrezeptors an das Cullin-RING-Adaptergerüst, sowie die spezifische Interaktion des Rezeptors mit Degron-Epitopen im Substratprotein.

Das CUL4-DDB1-DCAF System

Während CUL1, 2, 3 und 5 strukturell konservierte, kompakte Cullin-Adapter-Rezeptor-Architekturen aufweisen, wurde DDB1 als fundamental unterschiedlicher Adaptertyp für CUL4-Gerüste identifiziert. DDB1 besteht aus drei β-Propellerdomänen (BPA-BPC), wobei der N-terminus von CUL4 der BPB-Domäne interagiert [3]. BPA und BPC sind über ein flexibles Gelenk mit BPB verbunden [26]. Vergleichende Kristallstrukturanalyse von DDB1 im Komplex mit den DCAFs DDB2 und CSA zusammen mit Sequenzalignments und Peptid-soaking Experimenten zeigten weiterhin, dass einige DCAFs ein konserviertes, kryptisches Helix-Loop-Helix-Motiv (HLH box) besitzen, welches spezifisch mit der BPC-Domäne von DDB1 interagiert und dadurch den DCAF-Rezeptor mit dem CUL4-RING-DDB1 Subkomplex verbindet  [27, 28]. Die Struktur eines solchen DCAF-DDB1-CUL4-RING-Proteinkomplexes ist in Abbildung 1 dargestellt. Aktuelle strukturelle Studien des DDB1-Bindemodus von Cereblon, einem Thalidomid-bindendem DCAF, ergaben jedoch ein anderes Bild: hier interagieren die DCAF-Helizes 3-5 hauptsächlich mit der BPA-Domäne von DDB1 [29, 30]. Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse auf eine gewisse Plastizität von DCAF-DDB1-Interaktionen schließen. Systematische Interaktionsstudien sind notwendig, um diese Variabilität zu verstehen und um weitere potentielle DCAFs zu identifizieren.

DCAF-Substratinteraktionen

Ungefähr 50 putative DCAF-Substratrezeptoren wurden in Proteomanalysen identifiziert, davon 18 in mindestens zwei Studien (Tabelle 1, [27]). Die meisten dieser Proteine besitzen eine β-Propellerdomäne [31]. Die Kenntnis des Substrats und insbesondere das Verständnis der molekularen Faktoren, die zur spezifischen Substraterkennung durch DCAFs führen, beschränken sich jedoch auf wenige Fälle.

Ein gut beschriebenes Beispiel ist das bereits oben erwähnte DDB2-Protein, das mit hoher Affinität UV-induzierte DNA-Schäden bindet. Kokristallstrukturen von DDB1, DDB2 und beschädigten DNA-Sequenzen zeigen, dass sich die N-terminale HLH box von DDB2 auf der Unterseite der β-Propellerdomäne befindet. Auf der Oberseite des β-Propellers bindet spezifisch der beschädigte DNA-Doppelstrang. Dadurch werden chromatinassoziierte Proteine nahe des DNA-Schadens in Reichweite des CUL4-RING katalytischen Kerns gebracht, polyubiquityliert und abgebaut. Dies stellt einen wichtigen Schritt im Aufbau des globalen Nukleotid-Exzisionsreparaturmechanismus dar [27, 32, 33].

Auch über die Substratspezifität von DCAF1 (auch VPRBP genannt) gibt es einige Erkenntnisse. DCAF1 ist essentiell für die Embryonalentwicklung und für die DNA-Replikationsregulation [34]. DCAF1 erkennt Degronsequenzen des DNA-Replikationsfaktors Mcm10, dessen regulierte Proteolyse entscheidend für den Aufbau des DNA-Replikationskomplexes ist [35]. Weiterhin bindet eine N-terminale Chromodomäne in DCAF1 monomethylierte Peptidsequenzen, die durch die EZH2-Methyltransferase generiert werden, und führt dadurch zur Proteolyse des Zellkern-Rezeptors RORα mit Auswirkung auf die Gentranskription [36]. Außerdem besitzt DCAF1 eine putative Kinaseaktivität N-terminal der Chromodomäne, deren Relevanz für DCAF1-abhängige Ubiquitylierungsprozesse jedoch noch nicht weiter beschrieben ist [37]. Zusätzlich gibt es Hinweise, dass die N-terminale Domäne von DCAF1 die sogenannten TET-Dioxygenasen bindet und deren Monoubiquitylierung und daraus resultierende Aktivierung verursacht [38]. Zuletzt scheint DCAF1 auch an der konstitutiven Degradation der Uracil-DNA-Glykosylasen UNG2 und SMUG1 beteiligt zu sein [39].

DCAF2 (CDT2, DTL, CDW1, L2DTL, RAMP) ist verantwortlich für die Poly-Ubiquitylierung mehrerer Proteine, die DNA-Replikation und DNA-Reparatur regulieren, wie z.B. Cdt1, p21, Set8, Pol η, E2F, Chk1 and XPG [40-42]. Dabei ist interessant, dass die meisten dieser Substrate nur im Komplex mit DNA-gebundenem PCNA-Protein ein zusammengesetztes Degron präsentieren, welches dann durch den DCAF2-Substratrezeptor erkannt wird. Dieser Mechanismus stellt wohl die korrekte räumlich-zeitliche Proteinabbau-Regulierung sicher [40, 43].

DCAF3 (AMBRA1) ist wichtig für die Autophagie-Regulation und scheint außerdem den Turnover des Proto-Onkogens c-myc zu beeinflussen [44-46].

DCAF7 (HAN11, WDR68) wurde ursprünglich als Gerüstprotein für die Kinasen DYRK1A, DYRK1B, HIPK2 and MEKK1 identifiziert [47, 48], und außerdem als Adapter, um diese Kinasen mit dem adenoviralen Onkoprotein E1A zusammenzubringen [49]. Kürzlich wurden auch eine Proteomanalyse und funktionale Folgeexperimente veröffentlicht, die zeigten, dass DCAF7 die Poly-Ubiquitylierung und den Abbau der DNA-Ligase I induziert [50].

DCAF8 (H326, WDR42A) fungiert als Substratrezeptor für CDC25 und leitet dadurch dessen Polyubiquitylierung und proteasomalen Abbau ein [51]. Genetische Analysen lassen weiterhin vermuten, dass eine Mutation in DCAF8 die Ursache einer Variante der vererblichen axonalen motorischen und sensorischen Neuropathie ist [52].

DCAF9 (WDTC1, Adipose) ist ein konservierter Suppressor von Lipidakkumulation, auch beteiligt an der Entstehung humaner Adipositas [53, 54]. DCAF9 induziert die Monoubiquitylierung der Aminosäurenseitenkette K119 des Histons H2A über CUL4-DDB1, ein Prozess, der epigenetische  transkriptionelle Repression reguliert [55].

DCAF11 (WDR23) wurde kürzlich als CUL4-DDB1-Substratrezeptor für SLBP identifiziert. SLBP ist ein Hauptfaktor in der Prozessierung von Histon-mRNA. Es ist jedoch umstritten, ob DCAF11-induzierte SLBP-Ubiquitylierung dessen Degradation oder dessen Aktivierung reguliert. SLBP-Phosphorylierung könnte außerdem für die DCAF11-Bindung wichtig sein [56, 57]. In C. elegans reguliert DCAF11 den Abbau des Transkriptionsfaktors SKN-1, möglicherweise in Abhängigkeit von SKN-1-Phosphorylierung [58].

 Insgesamt ist jedoch festzustellen, dass das Substratspektrum der CUL4-DDB1-DCAFs noch nicht vollständig beschrieben ist, und dass diverse Mechanismen Anwendung finden, um Substratspezifität im CUL4-RING System zu erreichen. Insbesondere DCAF1 scheint multiple Degron-Erkennungsmechanismen aufzuweisen, determiniert durch separate Bindedomänen. Dies könnte auch für die Multidomänen-DCAFs 3, 6, 9, 14 und 19 zutreffen. Molekulare Modelle dieser Bindungsvorgänge sind unabdingbar, um insbesondere DNA-Replikation, DNA-Reparaturprozesse und Transkriptionsregulation zu verstehen.

Spezifitätsmodulierung von DCAF1 durch Virenproteine

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Abbildung 2
Umlenkung der DCAF1-Spezifität durch das akzessorische Protein Vpx, isoliert aus Affen-Immunodefizienzviren, die entweder Sooty Mangabeys infizieren (SIVsmm, A), oder Mandrills (SIVmnd-2, B). Beide Vpx-Proteine binden DCAF1 auf die gleiche Weise, erkennen jedoch verschiedene Abschnitte des SAMHD1-Restriktionsfaktors durch unterschiedliche Mechanismen. DCAF1-SIVsmm Vpx bindet den C-Terminus von SAMHD1 (SAMHD1-CtD, [68]), während DCAF1-SIVmnd-2 Vpx spezifisch den SAMHD1 N-Terminus erkennen (SAMHD1-NtD, [69]). In den unteren Bildabschnitten ist die ungefähre Position der mittleren, katalytischen Faltungsdomäne von SAMHD1 schematisch gezeigt. Beide Bindungsprozesse führen zur SAMHD1 Poly-Ubiquitylierung und zur darauffolgenden proteasomalen Degradation.

Ein wichtiger Aspekt des Cullin-RING-Systems ist die Interaktion mit viralen Proteinen in infizierten Zellen. Retroviren entwickelten in einem evolutionären Anpassungsprozess Maßnahmen gegen antivirale Faktoren des Wirts [59]. Diese retroviralen "akzessorischen" Proteine nutzen oft das Proteasom-Ubiquitin der Wirtszelle zu ihren Gunsten, um frühe intrazelluläre Infektionsbarrieren zu überwinden, die sogenannten Restriktionsfaktoren [60]. Dabei wird insbesondere auch die Spezifität von Cullin-RING Ligasen auf diese antiviralen Wirtsproteine umgelenkt, was deren Proteolyse erwirkt und dadurch bessere Replikationsbedingungen für den Virus erzeugt [61]. Wichtige Beispiele sind die Modifikation des CUL5-Substratrezeptors Elongin B/C durch das HIV-1 akzessorische Protein Vif, was zum proteasomalen Abbau des Restriktionsfaktors APOBEC3G führt [62, 63], oder Proteolyse des Restriktionsfaktors Tetherin, die durch Modifikation eines CUL1-Substratrezeptors durch das HIV-1 akzessorische Protein Vpu eingeleitet wird [64, 65]. Auch die proteasomale Degradation des SAMHD1-Restriktionsfaktors wird durch Interaktion des HIV-2 akzessorischen Proteins Vpx mit dem CUL4-Rezeptor DCAF1 und durch die daraus resultierende Veränderung der DCAF1-Substratspezifität verursacht [66, 67]. Wir haben bereits die divergenten Mechanismen der SAMHD1-Erkennung durch DCAF1 und Vpx isoliert aus zwei verschiedenen Affen-Immunodefizienzviren (SIVs) charakterisiert (Abbildung 2, [68, 69]). Generell liefern solche strukturellen Analysen nicht nur einen direkten Einblick in Virus-Wirt-Adaptationsprozesse, sondern können durchaus auch neue therapeutische Möglichkeiten liefern, da intrazelluläre Restriktionsfaktoren nachweislich Einfluss auf den Virus-Tropismus ausüben [70, 71].

Die Funktion des zu Vpx paralogen akzessorischen Proteins Vpr verbleibt jedoch ungeklärt. Vpr ist in HIV-1 und einigen SIVs vorhanden und wichtig für die Virenreplikation in vivo. Vpr bindet ebenfalls an DCAF1 und induziert die Degradation der Uracil-DNA-Glykosylasen UNG2 und SMUG1 und der DNA-Translokase HLTF in der Wirtszelle [39, 72-76]. Der molekulare Mechanismus der Vpr-induzierten Spezifitätsumlenkung von DCAF1 auf UNG2 wurde kürzlich beschrieben, und es stellte sich heraus, dass die DCAF1-Bindemodi von Vpr und Vpx sehr ähnlich sind [73]. Studien in menschlichen und Affensystemen identifizierten darüber hinaus den SLX4-Proteinkomplex als Interaktionspartner von Vpr-modifiziertem DCAF1. Der SLX4-Komplex ist wichtig für die DNA-Reparatur in der späten Phase von homologen Rekombinationsprozessen [77]. In einem noch ungeklärten Mechanismus führt DCAF1-Vpr-Interaktion zur frühzeitigen Aktivierung des SLX4-Komplexes, und ultimativ zum Zellzyklusarrest in der G2 Phase, was mit einer Verbesserung der Bedingungen für die Virenreplikation einhergeht [78, 79]. Polyubiquitylierung der SLX4-Komplex-Komponenten Mus81 und Eme1, induziert durch DCAF1-Vpr, könnte in diesem Prozess eine Rolle spielen, ist jedoch nicht korreliert mit dem Zellzyklusarrest-Phänotyp [80]. Interessant ist weiterhin, dass einige SIV-Vpr Varianten zusätzlich zur SLX4-Komplex-Modifikation  auch noch die Degradation des SAMHD1-Restriktionsfaktors der jeweiligen Wirtsspezies induzieren, nicht jedoch HIV-1 Vpr [81, 82]. Molekulare Modelle der Vpr-DCAF1-Interaktion zusammen mit der Identifikation der jeweiligen SLX4- und SAMHD1-Degronsequenzen sind unabdingbar, um beide Vpr-Phänotypen zu verstehen (Zellzyklusarrest versus SAMHD1-Degradation), und um zu überprüfen, in welchem Verhältnis diese Phänotypen zueinander stehen, und welche Auswirkungen sie auf die Virusreplikation haben.