Forschung

Das Institut für Medizinische Physik und Biophysik konzentriert sich auf Grundlagenforschung. Hier forschen Projektgruppen zu einer Vielzahl von elementaren, spannenden Themen auf dem Gebiet der Biophysik. Es wird auch in zahlreichen Verbundprojekten gearbeitet, wie

  • dem Sonderforschungsbereich 740, dem Sonderforschungsbereich 958 sowie dem Sonderforschungsbereich 1078,
  • der Forschergruppe 1805,
  • dem Exzellenzcluster NeuroCure sowie
  • dem Exzellenzcluster UniCat.

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Die Forschungsschwerpunkte des Instituts

Die zentralen Forschungsfelder am IMPB können in zwei Schwerpunktgebiete unterteilt werden.

Strukturaufklärung makromolekularer Maschinen und funktionaler Komplexe

Ein Schwerpunkt ist die Strukturaufklärung makromolekularer Maschinen und funktionaler Komplexe mit Schwerpunkt Ribosomen mit dem Ziel, Vorgänge und Kontrollmechanismen der Proteinbiosynthese genauer zu verstehen. Der methodische Schwerpunkt liegt hierbei auf der Kryo-Elektronenmikroskopie und Röntgenstrukturanalyse.

Visuelle Signaltransduktion


Zum anderen wird an der Aufklärung der Vorgänge bei der visuellen Signaltransduktion, im Hinblick auf die Protein-Kofaktor-Interaktion, Struktur und Funktion von Rezeptorproteinen sowie Signalweiterleitung über biologische Membranen geforscht. Hierbei werden biophysikalische sowie strukturbiologische Methoden angewendet, wie die zeitaufgelöste Spektroskopie und Röntgenstrukturanalyse.

Forschungsbeauftragter des Instituts

Biophysikalische Techniken

Die Forschungsprojekte des Instituts für Medizinische Physik und Biophysik sind hochgradig multidisziplinär ausgerichtet. Es kommen u.a. folgende biophysikalische und strukturbiologische Techniken zum Einsatz:

3D-Kryo-Elektronenmikroskopie von Makromolekülen

Im Laufe des vergangenen Jahrzehnts zeigte sich immer deutlicher, dass die grundlegenden und lebenswichtigen biochemischen Abläufe in Zellen nicht auf zufällig miteinander interagierenden Proteine basieren, sondern die Mehrzahl der essentiellen Prozesse werden von makromolekularen Komplexen mit 10 oder mehr Komponenten katalysiert (Alberts B, 1998, Cell 92:291). Diese aufgrund ihrer Größe und Flexibilität auch als molekulare Maschinen bezeichneten Komplexe sind mit ihrer Vielzahl an Liganden meist nicht für die klassischen strukturbiologischen Methoden wie Röntgenstruktur-Analyse oder NMR zugänglich. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) in Kombination mit Kryo-Präparationstechniken und entsprechenden Bildverarbeitunsmethoden (Einzelpartikel-Methoden "Random Conical Tilt", Tomographie) etabliert sich daher zunehmend als Methode der Wahl für die Strukturaufklärung großer Biomoleküle.

Bei der 3D-Kryo-Elektronenmikroskopie werden nach der biochemischen Präparation die Komplexe in möglichst nativen Pufferbedingungen in flüssigem Ethan (ca. -192°C) schockgefroren, so dass sie in einer dünnen Schicht von amorphem Eis fixiert vorliegen. Nach dieser vergleichsweise schonenden Konservierungsmethode können von der Probe in einem Kryo-Elektronenmikroskop viele Einzelbilder gesammelt werden. Die EM-Bilder entsprechen Projektionen der Elektronendichte der makromolekularen Komplexe in der Bildebene. Diese können mittels geeigneter Algorithmen 'in silico' wieder zurückprojeziert werden und so eine 3D-Rekonstruktion der Ausgangs-Struktur ergeben. Dazu muss es sich aber um Projektionen eines homogenen Objekts handeln und die räumliche Orientierung der Einzelbilder muss ermittelt werden. Die Ausrichtung der Einzelbilder kann über den Abgleich mit Referenzprojektionen einer Modellstruktur erfolgen (3D-Referenzprojektionsalignierung). Ist die Struktur des Komplexes gänzlich unbekannt, muss zunächst eine initale Struktur berechnet werden, was durch statistische Klassifizierung in Verbindung mit "Random Conical Tilt" und "Common Lines" Methode erreicht werden kann.

Da biologische Komplexe äußerst strahlungsempfindlich sind und nur bei geringen Elektronendosen abgebildet werden können, weisen die Aufnahmen zunächst ein sehr schlechtes Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf, welches durch Mittelung möglichst vieler Einzelbilder verbessert werden kann. Daher werden z.Z. 3D-Rekonstruktionen aus Datensätzen berechnet, die aus mehreren 100.000 Einzelbildern bestehen können.

Link zur Arbeitsgruppe Kryo-Elektronenmikroskopie am IMPB

Tertiärstrukturmodellierung und Moleküldynamik von Membranproteinen

Etwa ein Drittel des entschlüsselten Genoms kodiert Membranproteine. Viele Medikamente wirken durch Modulation von Membranproteinen, etwa auf G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR). Hingegen wurde bisher nur eine vergleichsweise geringe Anzahl von Membranproteinstrukturen aufgeklärt und in der PDB hinterlegt (September 2010: 1.8%). Grund hierfür sind die Schwierigkeiten beim Herstellen (meist Expremieren) größerer Mengen analysierbaren und zur Kristallisation benötigten Materials. Homologiemodelle werden daher alternativ für strukturbasiertes virtuelles Screening, also zur Rechner gestützten Suche nach neuen Wirkstoffen, unter zu Hilfenahme der Tertiärstruktur der Bindungsstelle genutzt.

Homologiemodellierung ist aber nur dann möglich, wenn Strukturen von homologen Proteinen existieren, was sehr häufig nicht der Fall ist. Um trotzdem geeignete Proteinmodelle zu erhalten, werden spezialisierte Ansätze gewählt, die häufig Struktureigenschaften gelöster Membranproteinstrukturen abstrahieren ('wissensbasierte Modellierung'), oder zusätzliche Information z. B. Mutationsanalysen oder Elektronendichten nutzen. Wir haben verschiedene Analyse-Methoden entwickelt und in Form der frei zugänglichen 'Werkbank' 'Rhythm', oder 'Superlooper', sondern auch zur Bestimmung funktionsspezifischer, struktureller Merkmale (z. B. Auftreten von Wasserstoffbrücken, Geometrie oder atomare Dichte der Helixpackung) und als Grundlage zur Beschreibung der molekularen Dynamik von Membranproteinen.

Kristallisation von Proteinen

Für die Proteinreinigung werden am Institut für Medizinische Physik und Biophysik zwei Chromatographiesysteme (GE HealthCare Lifescience ÄKTAprime plus und ÄKTApurifier 10) im Verbund mit einer statischen Lichtstreuung (WYATT –DAWN HELEOSII - 18-angle MALS light scattering detector) und einem Refraktometer (WYATT Optilab T-rEX - Differential Refractometer with Extended Range) eingesetzt.

Für die meisten Proteine sind sehr begrenzte Bereiche, z.B. des pH-Wertes, der Temperatur oder des Lösungsmittels notwendig, um die Stabilität zu gewährleisten. Geeignete Kristallisationsbedingungen findet man anschließend, indem man hochkonzentrierte Proteinlösungen (ca. 1 – 40 mg Protein/ml) mit verschiedenen Puffer-Lösungen, die zumeist sehr hohe Konzentrationen an Salzen, Alkoholen oder Polyethylenglykolen enthalten, in kleinen Tropfen mit Volumina im Nano- bis Mikroliterbereich vermischt, luftdicht abschließt und über einen Zeitraum (Tage bis Monate) bei konstanter Temperatur stehen lässt.

Die üblichen Methoden zur Kristallisation wie

  • Dampfdiffusion ("sitting & hanging drop"),
  • Kristallisation unter Öl ("Microbatch"),
  • Mikrodialyse oder
  • Mikro- und Makroseeding

von Kristallen verwendet. Mit Hilfe von standardisierten Bedingungen ("sparse-matrix-Technik") können aus ca. 4.000 Bedingungen systematisch herausfiltern, wo eine Kristallisation des Proteins möglich ist. Hierfür werden zwei Kristallisations-Roboter  (der TTP LabTech's mosquito , der bei einer Temperatur von 4 °C in einem eigenen Kühlraum in Betrieb ist, und der Art Robbins Instruments Gryphon LCP, der bei 20 °C auch "lipid cubic phase" Ansätze ermöglicht) verwendet. Weiterhin stehen diverse temperaturstabile Kristallisationsschränke, die bei verschiedenen Temperaturen ( 4 °C, 6 °C, 10 °C, 18 °C, 22 °C, 25 °C, 34 °C) betrieben werden, ein Kristallisationskühlraum, ein automatisches Imaging System (Formulatrix Rock Imager 182), ein UV-Mikroskop (Formulatrix MUVIS) zur Identifizierung von Proteinkristallen, diverse Stereomikroskope und verschiedene Lichtbedingungen für photosensible Proteine zur Verfügung.

Die Kristallisation von Membranproteinen ist häufig außerordentlich schwierig. Es wird aus diesem Grund am IMPB auch auf die Techniken der in surfo- ("detergent micelles methods"), bilayer- ("bicelle methods") und der in meso-Kristallisation ("lipid cubic phase methods") zurückgegriffen. Für letztere Methode stehen jetzt sowohl manuelle und automatische Lipid-Mixer also auch der Art Robbins Instruments Gryphon LCP Kristallisationsroboter zur Verfügung.

Röntgenstrukturanalyse von Proteinen

Streuexperiment am dreidimensionalen Kristall

Wird ein Protein-Einkristall mit Röntgenlicht bestrahlt, wirken die Netzebenen des Kristalls analog zu einem optischen dreidimensionalen Beugungsgitter. Die Röntgenstrahlung wird abgebeugt in Richtungen, die durch die Geometrie (Gitterparameter, Symmetrie) der Einheitszelle bestimmt werden. Für die Intensitäten der gemessenen Reflexe ist die Anordnung der Atome innerhalb der Einheitszelle maßgebend. Zur Analyse der 3D-Struktur wird der Kristall im Röntgenstrahl wiederholt um einen kleinen Winkel rotiert und dabei die gebeugte Röntgenstrahlung mit einem Detektor registriert. Aus den gemessenen Intensitätsdaten ist auf die Anordnung der Atome in der Elementarzelle zurück zu schließen.

Um einen Proteinkristall an einer geeigneten Strahlenquelle zu messen, verwenden die Forscher und Forscherinnen des Instituts für Medizinische Physik und Biophysik einen Charité-internen Drehanodengenerator (Siemens MAC-Science). Weiterhin werden von uns die Synchrotronstrahlenquellen des BESSY (Berlin, Deutschland), DESY (Hamburg, Deutschland) ESRF (Grenoble, Frankreich) und SLS (Villigen, Schweiz) aufgrund ihrer hervorragenden Eigenschaften, wie die sehr hohe Intensität und hohe Brillanz der Strahlung, ausgiebig genutzt.

Phasenbestimmung und Modellerstellung der Proteinstruktur

Das vom Kristall gebeugte Wellenfeld enthält die notwendige Information über die Kristallstruktur in Form von Wellenamplitude und Phase. Die Schwierigkeit dabei ist, dass Röntgendetektoren nur die Intensität (das Quadrat der Wellenamplitude der Reflexe) misst, die Streuphasen aber auf geeignete Weise rekonstruiert werde müssen ("Phasenproblem der Kristallographie"). Zur Lösung des Phasenproblems greift man auf verschiedene Strukturlösungs-Methoden zurück, wie etwa der einfache (SIR) oder multiple (MIR) isomorpher Ersatz, die anomale Dispersion bei einzelnen (SAD) oder mehreren Wellenlängen (MAD) und der molekularer Ersatz (MR).

Nach verschiedenen Strukturberechnungs- und Modifikationsverfahren können sogenannte Elektronendichtekarten erstellt werden, in denen dann die Proteinsequenzen als dreidimensionale Strukturen eingefügt werden. In den weiteren Schritten wird die Proteinstruktur in Verfeinerungsprozeduren optimiert. Als öffentliche zugängliche Datenbank, in denen die Proteinstrukturen abgelegt werden, dient die "Protein Data Bank"